"항원성시험"이라 함은 시험물질이 생체의 항원으로 작용하여 나타나는 면역원성 유발여부를 검사하는 시험을 말한다.
서비스 가능 항목
아나필락시스 쇼크반응시험(ASA)
수동피부 아나필락시스 반응시험(PCA)
피부감작성 시험
광독성 및 광감작성 시험
시험방법
항원성시험으로 아나필락시스 쇼크 반응시험 및 수동 피부 아나필락시스 반응시험 등을 실시한다. 단, 피부외용제의 경우는 피부감작성시험을 실시한다.
시험항목
아나필락시스 쇼크 반응시험
시험동물
시험동물은 기니픽을 사용한다.
시험방법
용량은 추정되는 임상용량으로부터 선정한다.
투여경로는 피하, 또는 복강내로 하는 것이 일반적이나, 임상적용 경로로 투여하여도 무방하다.
시험군은 원칙적으로 1군당 5마리 이상으로 하여 대조군, 양성대조군 및 시험물질 투여군을 두며, 시험물질 투여군은 저용량군과 고용량군의 2군 이상으로 하고 거대분자와의 결합 여부, 면역보조제와의 혼합투여 여부에 따라 필요한 군을 설정한다.
시험물질에 따라 거대분자와의 결합 여부를 결정하여 시험을 실시하며 용매는 0.9%(w/v) 생리식염수를 사용한다. 대조물질로는 시험물질에 따라 항원성이 알려진 저분자 물질, 또는 이종단백을 사용한다.
모든 용액은 시험 당일에 조제하며 감작과 야기시 원하는 농도로 준비한다.
감작시 대조군에는 0.9%(w/v) 생리식염수를 투여하고, 양성대조군에는 양성대조물질을 투여하여 감작한다. 면역보조제를 사용하지 않는 시험군에는 시험물질을 단독으로 피하, 복강내 또는 임상경로에 준하여 반복투여(주 2-3회, 2-4 주간)하여 감작한다. 면역보조제를 사용하는 시험군은 적당한 면역보조제와 혼합하여 피하, 복강내, 또는 피내에 적절한 간격(1-3주)으로 3회 이상 반복투여하여 감작한다.
최종 감작 1-3주 후에 시험물질(야기항원)을 정맥내 투여하여 아나필락시스 쇼크 증상의 발현 유무를 검색한다. 야기항원량은 원칙적으로 감작에 이용한 저용량의 수배로 한다.
결과의 판정
시험결과는 아나필락시스 쇼크 반응시험 판정기준에 따라 판정한다.
수동 피부 아나필락시스 반응시험
시험동물
이종 수동 피부 아나필락시스 반응시험의 경우 항혈청 제조에 C57BL/6계 마우스 또는 적당한 근교계 마우스를 사용하며, 반응 야기에는 랫드를 사용하고, 동종 수동 피부 아나필락시스 반응시험의 경우 항혈청제조 및 반응 야기에 기니픽을 사용한다.
시험방법
용량은 추정되는 임상용량으로부터 선정한다.
투여경로는 피하, 또는 복강내로 하는 것이 일반적이나, 임상적용 경로로 투여하여도 무방하다.
시험군은 원칙적으로 1군당 5마리 이상으로 하여 대조군, 양성대조군 및 시험물질 투여군을 두며, 시험물질 투여군은 저용량군과 고용량군의 2군 이상으로 하고 거대분자와의 결합 여부, 면역보조제와의 혼합투여 여부에 따라 필요한 군을 설정한다.
시험물질에 따라 거대분자와의 결합 여부를 결정하여 시험을 실시하며 용매는 0.9%(w/v) 생리식염수를 사용한다. 대조물질로는 시험물질에 따라 항원성이 알려진 저분자 물질, 또는 이종단백을 사용한다.
모든 용액은 시험 당일에 조제하며 감작과 야기시 원하는 농도로 준비한다.
감작시 대조군에는 0.9%(w/v) 생리식염수를 투여하고, 양성대조군에는 양성대조 물질을 투여하여 감작한다. 면역보조제를 사용하지 않는 시험군에는 시험물질을 단독으로 피하, 복강내 또는 임상경로에 준하여 반복투여(주 2-3회, 2-4 주간)하여 감작한다. 면역보조제를 사용하는 시험군은 적당한 면역보조제와 혼합하여 피하, 복강내, 또는 피내에 적절한 간격(1-3주)으로 3회 이상 반복투여하여 감작한다.
최종 감작 1-3주 후에 채혈하여 항혈청을 개체별로 분리한다.
반응 야기를 위하여 위에서 얻은 개체별 항혈청을 제모한 시험동물의 등부위에 피내주사한다. 항혈청은 적당한 배율까지 연속배수희석(4배, 8배, 16배,...)해서 약 0.05-0.1 ml정도 주사하며 이때 대조군 시험동물의 혈청도 동량 주사한다. 각 혈청당 2-3마리의 시험동물에 주사한다. 감작시킨 시험동물은 사육상자에 넣어 수용하며 24시간 후에 시험물질(야기항원)을 시험동물에 투여한다. 이때 투여할 시험물질 용액은 동량의 1-3%(w/v) Evans blue와 혼합하여 각 시험동물의 정맥내에 투여한다. 야기항원량은 원칙적으로 감작에 이용한 저용량의 수배로 한다.
야기항원 주사 30분 후에 시험동물 각 개체를 경추탈골 또는 마취하에 치사시켜 등부위 피부를 절취해서 피부안쪽의 청색 반점을 관찰한다.
결과의 판정
출현한 청색반의 장경과 단경의 평균치가 5 mm 이상이면 양성으로 하고, 양성을 나타내는 가장 마지막 혈청희석액의 희석 배수(최대 희석 배수)를 그 혈청의 최종 역가(항체가)로 정한다.
피부감작성시험
시험동물
원칙적으로 기니픽을 1주정도 순화하여 사용한다. 암컷을 사용하는 경우에는 임신하지 않은 것 또는 임신의 경험이 없는 것을 사용한다.
시험군은 각 군당 5마리이상으로 하며 원칙적으로 시험물질군, 용매대조군 및 양성대조군을 설정한다.
시험방법
시험물질이 고형제일 경우 증류수 또는 적절한 용매에 습윤시켜 균일하게 적용하며 반고형제 및 액제의 경우 희석하지 않고 사용한다. 에어로졸제는 필요에 따라 희석하여 사용한다.
1차 감작 : 제모한 시험동물의 등부위 피부(약 2×4cm)에 다음과 같은 3종의 시료를 좌우 대칭으로 피내주사한다.
2차 감작 : 1차 감작 1주 후 시험물질을 피내주사했던 부위에 시험물질을 포함하는 패취(2×4cm)를 부착하여 48시간동안 폐색첩포한다.
야기 : 폐색첩포 2주 후 시험동물의 등부위 혹은 측복부(감작부위와는 다 른 부위여야함)를 제모하고 시험물질을 포함하는 패취(2×2cm)를 부착하여 24시간동안 폐색첩포하여 야기시킨다.
결과의 판정
패취제거 24시간 및 48시간 후의 피부반응을 평가하며 이에 기초하여 시험물질의 피부감작성을 평가한다.
광독성 및 광감작성 시험
A. 광독성 시험
시험동물
시험동물은 기니픽을 사용한다.
시험군은 각 군당 5 마리 이상으로 하며 원칙적으로 시험물질군, 용매대조군 및 양성대조군을 설정한다.
시험방법
제모한 동물의 등배부를 두곳(1.5 cm x 1.5 cm / site)으로 나눈 후 시험물질을 도포한다. 등배부 오른쪽 절반은 알루미늄 호일로 차단하여 UV가 닿지 않도록 하고 나머지 부분만 UV를 조사한다. 이때, UV 광량은 UVA에서 15 J/cm2가 될 때까지 조사한다.
결과의 판정
조사종료 24, 48 및 72 시간째 적용부위의 피부반응 평가를 실시하고 이를 토대로 광독성 유무를 판정한다.
B. 광감작성 시험
시험동물
시험동물은 기니픽을 사용한다.
시험군은 각 군당 5 마리이상으로 하며 원칙적으로 시험물질군, 용매대조군 및 양성 대조군을 설정한다.
시험방법
유도 및 감작: 제모한 동물의 경배부 피부(4 x 2 cm2)에 시험물질을 제모 부위 전체에 걸쳐 고르게 도포한 뒤 UVA를 30 J/cm2으로 조사한다. 감작 후 멸균주사용수로 도포 부위를 닦아준다. 이 과정을 1 일 1 회, 3 일 간격으로 총 3 회 반복 실시한다.
야기: 광감작 개시일로부터 4 주 후 동물의 하배부를 제모한 뒤 척추를 중심으로 대칭이 되도록 1.5 x 1.5 cm 정사각형 구획의 투여부위를 양쪽으로 각각 1 구획씩, 총 2 구획을 정한 뒤, 시험물질을 투여부위에 도포한다. 척추를 중심으로 오른쪽은 알루미늄 호일로 감싸고(자외선 조사를 차단) 왼쪽은 UVA(305 - 420 nm)를 9 J/cm2 으로 조사한다. 조사가 종료되면 멸균주사용수를 이용하여 도포부위를 닦아준다.
결과의 판정
광야기 24, 48 및 72 시간째 적용부위의 피부반응 평가 및 감작률을 평가하여 광감작성을 판정한다.
(주)코아스템켐온